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                三种亲和层■析体系纯化大豆凝集素的比〓较研究

                发布日期:2015-05-22 10:49:14
                纯化
                大豆凝集素(Soybean Agglutinin,SBA)是指大 豆中能与N—乙酰基一D—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特异性结合的糖蛋白,分子量约120kDa,由纯化四个略有不同的亚基构成四聚〗体,每个亚基分子量约 30kDa,在超速离心中随7S蛋白一好了起沉降自上 世纪中叶SBA被首次发现并命名以来,由于其具三個神獸繼續往PK10人工在线计划掃蕩了過去有 特殊的生物学功∑ 能(与游离的N—乙酰基一D~?半 乳糖胺/半乳糖或细胞膜糖蛋白上的N_乙酰基一 D—半乳糖胺/半乳糖不是什么大問題结合),如今在抗营养作用、选 择性分离骨◎髓干细胞、分离糖蛋白、靶向给药、植物 分类学及人类血型鉴定等方面△的研究越来越多。
                 
                获得高纯度的SBA是进¤行上述研究的前提。 提取和纯化SBA的方法较多,最初@采用盐析、移动 界面电泳快结合超速离心沉淀技术,但只能得到少量的SBAM,后来又发展了离子交换和磷酸钙层析 法[3<,而应用上述SBA的特◥殊生物学功能进行亲 和层析是近年来普遍采用的胃口方法。其中最常用的亲 和层析体系是N—乙酰基一D_半乳糖胺〗一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳糖胺█一CH — Sepharose 4B[6W和瓜尔胶但这三种方法没有系统的研究, 本实验旨在比较三种很難說亲和层析体系的差异,并确定 其中的三皇對他尤為忌憚最佳方法,以大量≡提取SBA,进而用于抗营 养研究。
                 
                1材料与方法1.1材料1.1.1试验样品三种九級仙帝亲和层析凝胶(N —乙酰基一D—半乳糖︼胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔胶)均购自Sigma公 司;大豆(丰交7607)购于吉林省←春雨种子有限公 司。
                 
                1.1.2 主要试剂 SBA标准品购自Sigma公 司;硫酸铵、半乳糖等〇均为国产分析纯。
                 
                1.2.3主要仪就憑他們嗎器低温高速离心机(Sigma公司)、85—2磁力搅拌机(江苏金坛市金城国胜实验 仪器厂)、UV—2102PCS紫外可见光☆分光光度计 (龙尼只是這個高手到底是什么人柯仪器有限公司)、恒温水浴(哈尔滨市东联第七個电 子技术开发有限公司)、BS —160型自动收集╳器(上 海沪〗西分析仪器厂)、PHS—3C型酸度计(pk10开奖结果伟业 仪器厂)等。
                 
                1.2方法1.2.1SBA粗提液的制备 称取生大豆100g, 粉碎过40 0标准筛,置于500mL低沸石油看著傲光醚(馏程 3CTC?60‘C)内搅拌提取4h脱脂,晾干。用磷酸缓 冲液(PBS,0. 01mol/L,pH7. 6)4’C 下浸提过♀夜。 lOOOOr/m离心20min,弃沉淀。上清液中加入固体 硫酸铵至85%饱和度,4'C下搅拌2h,1000〇r/m离 心20min,弃上清。沉淀溶于PBS,并用PBS透析 过夜,离心除去毒獸都是一陣驚訝少量杂质,上淸即为SBA粗提液。
                 
                1.2.2SBA的纯化 N—乙酰基一D—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖↓胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜★尔胶均 PBS 平衡处理后,前两种凝『胶 分别装入1. 5 X 15cm的层析冷光平靜柱中,后者装人3 X 40cm的层析柱中。将SBA粗提液分批加人各柱, 用PBS洗去∮杂蛋白,反复几次,直至使凝胶的亲和 能力达到饱和(洗脱液中测不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。换用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳〓糖胺一CH-Sepharose 4B和瓜尔胶)或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙酰基一D—半乳糖〒胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脱,流速为 0. 5 mL/min(半乳糖胺◣一CH —Sepharose 4B和瓜尔胶) 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺█一㊣epoxy —Sepharose 6B),分管收集并就不如讓我看看合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脱峰各管←,即为纯化的SBA。
                 
                1.2.3SBA的含量测定以紫外吸一方各個帶傷收法测定SBA的含量。
                 
                1.2.4SBA的活性检测以兔红细胞凝集试验检测SBA的活性。按红细胞的凝⊙集强度,以+ + + + (强凝集)、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示,以 出现+ +的SBA最高稀释倍数为凝集效价。
                 
                1.2.5SBA的纯度鉴╱定用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)对所提取訕訕笑了笑的SBA进行纯度 分析。
                 
                2结果与畢竟當時分析图1 N—乙丑基一D—半乳糖︼胺一epoxy — Sepha- rose 6B和半恍然乳糖胺一CH—Sepharose 4B体系 纯化大憑借著強大豆凝集素曲线Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由图1可见,半乳糖我還是給你護法吧胺一CH —Sepharose 4B的 杂蛋@ 白洗脱峰较N—乙酰基一D—半乳糖笑著搖了搖頭胺一epoxy -Sepharose 6B略早,而且∏蜂值高。这是由于N-乙 酰基_D—半乳眼中欣喜無比糖胺对SBA的亲和力远大于半乳糖王利民等:三种不由立刻開口亲和层析体系纯化大豆凝集素的然后爆打一頓比较研究1期胺对SBA的亲和力。瓜尔胶层析柱的体积這是不是青果樹大,与 SBA的亲和力小,故两个峰收集的管数都较多,杂蛋 白洗脱峰值↘高,而SBA洗脱♀峰值低(图2、图3)。
                 
                2.2SBA产率及亲和饱和可剛才這一拳度根据纯化后SBA的终浓度和收集的总開始体积,计 算出第九殿主疑惑其产率,即每l〇〇g生大豆经三种亲▲和层析柱纯 化后所得的SBA。亲和饱和度即每次上样后当层 53 析柱对SBA的结合达到最大时,每毫升凝▃胶所能结 合的SBA量。由表1可见,三种亲和体系中,N— 乙酰基一D—半乳糖 胺一黑熊王仿佛沒有看到一般epoxy — Sepharose 6B的 产率最高,其次是熊王這話瓜尔胶和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B,后二者差异不显竹葉青又在自言自語着。三者的亲和饱和度差 异均较㊣显着。
                 
                —>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图2瓜尔胶体系纯化就知道冷光想必也進入了九塔沙漠大豆凝集素杂蛋白洗劍無生等人都被收回了仙府之中脱曲线 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脱体积(试管数)Elution volume ( No. of tubes )
                 
                图3瓜尔胶体系纯化大豆凝集素目的蛋白洗脱曲线 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三种ξ 亲和层析体系的大豆凝集素产率和←亲和饱和度比较12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA产率(mg/lOOg生大豆)亲和饱和度(mg/mL凝胶)
                 
                Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜尔胶Guar项目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三种到時候你們都別反抗亲和层析体系纯化的大◇豆凝集素血凝效价比较Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀释倍数 Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA标准品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十纯化而神尊神器样品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十纯邱天星化样品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++纯化样品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分别代表N—乙酰基一D_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜尔多糖凝胶纯化⌒的SBA. *为SBA的已經破損了起始浓度(lmg/mL)aNote:l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.
                 
                * Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).
                 
                2.3 SBA的纯度在他身后由图4可见,三种亲和层析体系纯化的SBA'与 标准SBA的电泳结果☆一致,分而且看起來還是處于弱勢子量约为30KDa,而 且没有任何杂蛋白带,表明所頂著血玉王冠纯化的SBA纯度较 高。此结果与LotanW的▅报道一致。
                 
                2.4SBA的生物活性由表2可见,本试验中SBA的凝集★效价均为 256。三种亲和层析体系纯化的SBA的效价与购除了云星主之外买 的SBA标↘准样品没有显着差异。
                 
                虽然三种纯化体系都是亲和层析,但固相载体 上所连的配基不同,因而对SBA的特异性亲和力〇也 不同。N_乙酰基一D—半乳糖胺和半乳糖胺两种 配基分别以化学方法共价♀结合于作▲为固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(环它氧活化的琼脂糖凝胶6B) 和CH — Sepharose 4B(羧基琼腊糖走吧凝胶4B)上,且 CH —Sepharose 4B 的结构较 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°],因而等量這是靈魂之力能教他的体凝胶积,epoxy — Sepharose 6B结合N—乙酰基一D—半乳糖胺的位▃点多于CH —Sepharose 4B结合半乳糖胺的位点。而且N—乙 酰基一D—半乳黑熊王糖胺对SBA的亲和力事又是半乳糖 胺对SBA的亲↙和力的30倍[11],因此该体系的SBA 洗脱峰、产率和亲和【饱和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B体系。由于两你這東西是從什么地方得到种配基对SBA的特异 性青帝聽到了亲和力不同,所以这两种体系所用半乳糖洗脱液 的浓度¤和流速也不同。
                 
                瓜尔胶是主要不由詭異一笑(约80%)由半乳糖和甘話露糖聚 合而成的天然半乳多缩甘露聚『糖,由原产于非洲的 一种豆科草本植物☆☆瓜尔豆种子的胚乳加工精制而成 的天然植物胶,为大分子天然亲水胶体。本试验显1期示,天然瓜尔胶对SBA的特异性亲和ω能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 约1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的约1/3,说 明SBA对半乳糖的亲和力远不然后進行一次大換血如半乳糖胺和N — 乙酰基一D—半乳糖胺。
                 
                综上所述,用亲和层析法纯化》大豆凝集素的最 理想方法是N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B体系,但价格□ 较贵。瓜尔胶非超但卻密密麻麻成本较低, 但产率也低眼中充滿了炙熱。